急性川崎病患者外周血单核细胞的单细胞RN

川崎病(KD)是发达国家儿童获得性心脏病最常见的病因，它是一种急性全身性发热性疾病和儿童时期的血管炎，可导致冠状动脉病变(CALs)。虽然免疫细胞的功能和表型改变已有报道，但对急性KD背后的免疫反应尚不清楚。本文使用单细胞RNA测序方法，分析了7名急性KD患者静脉注射免疫球蛋白治疗前后和3名年龄匹配的健康对照的外周血单核细胞。通过研究确定了每种细胞类型变化潜在的生物学过程，同时先天免疫反应和获得性免疫反应的单细胞图景为KD的发病机制和治疗提供了见解。

研究结果

1.PBMCs的研究设计和单细胞RNA图谱

本文收集了来自7名急性KD患者的14份新鲜外周血液样本。对于每个患者，在静脉注射免疫球蛋白(IVIG)治疗前，发烧后第5天采集第一份血样。第二个样本是在IVIG治疗结束和退烧后24小时获得的。所有患者对IVIG治疗均有反应，均未发生冠状动脉病变(CALS)。我们还收集了3名年龄匹配的健康捐献者的新鲜外周血液样本作为对照。

对样本中分离的PBMC进行scRNA-seq以及单细胞B细胞受体测序(scBCR-seq)和单细胞T细胞受体测序(scTCR-seq)，分别获得，和个细胞。聚类得到的主要细胞类型包括CD4+T细胞，CD8+T细胞，NK细胞，B细胞，浆状树突细胞和造血干细胞(图1)。PBMCs中还混杂有残留红细胞和巨核细胞。结果发现与健康对照组相比，治疗前KD患者的单核细胞和B细胞的百分比增加，而T细胞和NK细胞的百分比降低。

图1scRNA-seq鉴定的细胞类型的二维图

2.PBMCs主要免疫细胞类型的动态变化

对另外16名完全性KD患者和20名健康捐献者的外周血淋巴细胞进行scRNA-seq和流式细胞术检测。结果显示，KD患者治疗前B细胞百分比高于治疗后，CD4+T细胞百分比低于治疗后(图2)。另外KD患者治疗前B细胞百分比显著高于健康对照组，治疗后迅速恢复正常，CD8+T细胞以及NK细胞的百分比也低于健康对照组。

IVIG治疗后，单核细胞的丰度明显降低。然而，在scRNA-seq数据中有一名患者(P1)显示治疗后单核细胞比例显著增加(图2)。为了排除任何潜在的技术偏差，作者检查了患者的常规血液检测数据中的scRNA-seq和流式细胞分析结果(图2)。数据证实治疗后单核细胞总体上显著减少，而仅P1表现出与scRNAseq相似的相反趋势。

图2不同条件下主要细胞类型的比较

3.单核细胞亚群和反应

作者进一步研究每种细胞亚型来剖析它们的异质性。图1scRNA结果显示单核细胞有两个亚群，包括CD14+单核细胞和CD16+单核细胞。IVIG治疗后，患者CD16+单核细胞百分率明显降低(图3)。据报道，CD16+单核细胞与许多包括急性KD在内的炎症状态密切相关。为了确定更多与免疫反应相关的基因，作者对每种细胞类型进行了差异表达分析。在所有PBMC群体中，最多的DEG来自于单核细胞。通过DEG的GO注释和通路过度表达分析，显示单核细胞显著富含S蛋白、免疫球蛋白受体、细胞因子受体、补体和受体以及MHCⅡ类受体。编码S蛋白的基因在治疗前KD患者中显著过度表达，大多数编码免疫球蛋白受体的DEG在治疗前过表达(图3)。相反，与健康对照组相比，KD患者中编码MHCⅡ类受体的大多数DEG表达下调(图3)。编码细胞因子和趋化因子受体的DEG的表达模式更加多样化，一些在治疗前患者中过表达，另一些在治疗后患者或健康对照中过表达。

高细胞分裂素血症是KD最重要的特征之一，IL-1B和肿瘤坏死因子是KD发病过程中的重要炎症介质，已被用作治疗IVIG耐药患者的靶点。作者发现IL-1B和TNF主要在PBMC中的单核细胞中表达，治疗前KD患者IL-1B和TNF表达上调(图3)。除S基因外，单核细胞也是表达CCL2、CXCL10、CXCL8、HGF、IL15、IL18、RETN和TNFRSF1B的主要来源(图3)。

图3单核细胞的特性和转录模式

4.B细胞亚群和BCR谱系

经鉴定B细胞主要包含4个亚群：初始B细胞，记忆B细胞，浆细胞以及介于初始和记忆细胞之间的细胞(图1)。IVIG治疗后浆细胞占B细胞总数的比例较治疗前增加。与治疗后相比，治疗前KD患者中许多与细胞周期相关的DEG上调，而抑制细胞周期的相关DEG下调，几个干扰素反应基因在治疗后也显示上调(图4)。作者通过对scBCR-seq数据的分析，探讨了急性KD时BCR谱系的动态变化。IVIG治疗后IgHA和IGHG百分率显著升高，提示免疫球蛋白由IgM/IgD向IgG/IgA的同型转换是由B细胞激活所致。通过患者独特的VDJ序列检查了BCR的克隆性，结果显示，除P7外的大多数患者中克隆性BCR(克隆性大小为≥3)的百分比在治疗后比治疗前、健康对照组显著增加。治疗后除P7患者外，其余患者均可观察到以IgA和IgG亚型为主的寡克隆性扩张(图4)，扩增克隆的IGHV基因在不同患者之间的使用是不同的(图4)。

图4B细胞和BCR的特性研究

5.T和NK细胞亚群以及TCR谱系

CD4+T和CD8+T细胞包括三个亚群(图1)：初始细胞，中央记忆细胞和效应记忆细胞。记忆CD8+T细胞也表达高水平的细胞毒性相关基因(GZMK、GZMB)。此外，还发现了调节性T细胞、γδT细胞和增殖T细胞。作者发现KD患者CD8+T细胞初始细胞的百分比显著增加，而效应记忆细胞的百分比显著降低，表明效应性记忆细胞在激活后能迅速获得细胞毒功能，是导致外周血单个核细胞CD8+T细胞减少的主要亚群。NK细胞包括两个亚群CD16高表达细胞(FCGR3A)和CD56高表达细胞(NCAM1，KLRC1)。

CD4+和CD8+T细胞中的许多DEG具有与免疫反应和能量代谢相关的相似表达模式。一组常见的DEG在CD4+和CD8+T细胞中的干扰素信号和反应都显著丰富(图5)。其中一些DEG在治疗前上调，另一些在治疗后上调。与B细胞相似，KD患者所有这些淋巴细胞群中S基因的表达均高于健康对照组(图5)。基因集富集分析(GSEA)发现CD4+和CD8+T细胞中几个标志性基因集的显著协调变化(图5)。在CD4+和CD8+T细胞中，观察到许多MYC靶基因，包括MYC本身在治疗前KD患者中显著上调(图5)。

scTCR-seq数据显示，克隆TCR的T细胞富含高表达GZMB的效应记忆CD8+T细胞，与BCR谱系的动态相似，观察到在IVIG治疗后，大多数患者的克隆性TCR的百分比明显增加(图5)，基尼系数也显著增加。这些结果再次支持了常规抗原可能是KD的致病原因。

图5T细胞和TCR的特征

研究结论

本文使用scRNA测序方法，分析了7名急性KD患者静脉注射免疫球蛋白治疗前后和3名年龄匹配的健康对照的外周血单核细胞，在急性KD患者单核细胞中鉴定出差异表达最大的基因是：高表达的促炎症介质、免疫球蛋白受体基因，低表达的MHCⅡ类基因。对另外16例KD患者的细胞进行的单细胞RNA测序和流式细胞仪分析表明，虽然治疗后B细胞总数的百分比显著降低，但浆细胞在B细胞中的百分比显著增加。川崎病急性期外周血CD8+T细胞百分率明显低于健康对照组，尤其是效应记忆性CD8+T细胞。

参考文献

Wang,Z.,Xie,L.,Ding,G.etal.Single-cellRNAsequencingofperipheralbloodmononuclearcellsfromacuteKawasakidiseasepatients.NatCommun12,().