血清外泌体microRNA组合可望作为候

生物样本库BS小组

川崎病是儿童后天性心脏病的主要诱因，迄今尚未见有效的诊断性生物标记物。我们利用血清外泌体microRNA旨在发现川崎病候选的诊断性生物标记物。本项研究以某生物样本库的冻存血清样品作为实验材料，利用高通量微陈列技术，两级实时定量PCR和自参照数据归一化策略，将生物标记物候选名单缩小至4个miRNA的一个组合，即CT(miR-)、CT(miR-b-5p)、CT(miR--3p)和CT(miR--5p)的组合。进一医院的79个样本中筛选的miRNA的诊断能力。结果发现4-miRNA组合在初筛实验中即可以最低的假阳性和假阴性率将川崎病患者与其它发热患者和健康个体区别开。因此，我们首次提出，血清中的外泌体miRNA组合可望作为川崎病的备选诊断性生物标记物。此外，我们还介绍了一种在原理机制未知的情况下筛选复杂疾病生物标记物的有效方法。

川崎病（KD）主要发生在5岁以下的儿童中，其特征是急性发热性皮疹，会导致冠状动脉病变。KD正在成为儿童获得性心脏病的主要原因。然而迄今为止，还没有针对KD的具体诊断测试，对于该病的诊断仍然高度依赖于病人所显现的症状和超声成像技术。静脉注射免疫球蛋白注射液（IVIG）和阿司匹林治疗已被用作对KD的有效治疗，可以将冠状动脉并发症的发生率从25％降低到5％。一些KD病例很容易被误诊为呼吸道感染，败血病，鼻出血，猩红热（SF），麻疹，淋巴节发炎或幼年特发性关节炎（JIA）。延迟治疗经常有很高的风险会导致冠状动脉损伤。

蛋白质组学技术已被应用于筛选KD的血清蛋白生物标志物。然而，最显著的异常表达的蛋白质是免疫反应的组分，如转甲状腺素蛋白（TTR），补体C3和血清白蛋白（ALB），或指示动脉病变的蛋白质，如fbrinogen和心肌肌钙蛋白I。我们以前的调查显示，血清蛋白如TTR的水平可以反映IVIG治疗的有效性，可以作为IVIG治疗反应的敏感标志。但是，它们对于KD的诊断则无效。

事实上，蛋白质组学方法具有其内在限制性，该限制性在以染色体为中心的人类蛋白质组学项目中就遇到过。这些限制包括由于数量上低丰度蛋白质的低灵敏度对检测带来的困难，对蛋白质的物理和化学性质的依赖性，很低的肽序列覆盖率，检测单个氨基酸突变的困难性，新蛋白质发现的低效性和基于抗体检测的“低染色问题”。由于这些缺点，蛋白质生物标志物往往比临床诊断中核酸生物标志物（例如，对三体性的产前诊断）具有更高的假阳性率和假阴性率。

在各种类型的核酸中，microRNA（miRNA）被认为是生物标志物的有希望的资源。miRNA代表了长度为17至25个核苷酸的功能性单链小RNA。miRNA介导靶基因的翻译调控，并在调控生理和病理过程中发挥重要作用。据估计，60-70％的人类编码基因受到miRNAs的调控。年，Mitchell等从健康个体的血浆样品中检测到37种miRNAs，包括let-7a，miR-16和miR-15b。他们发现miRNAs可以以稳定的形式存在于血浆中，从而逃避RNase降解。使用高通量测序技术，已经从人类血清中鉴定了超过种miRNAs。miRNA对各种生理和病理状态的特异性，是其具有作为诊断性生物标志物的潜力。

最近的研究发现，保留在微泡中的miRNAs免受RNase降解。大的微泡起源于凋亡和坏死细胞，产生了高的封装miRNA的背景，并且他们的水平在生理和病理情况下差异显著。清水等在从KD患者获得的微泡中分离筛选出六个差异表达的miRNAs，但发现这些miRNAs都不能区分KD与腺病毒感染，这表明来自大型微泡的miRNAs对于KD诊断其特异性不高。

作为另一种类型的直径为30-nm的小型微泡的外泌体，由大多数活细胞选择性且主动地包装并分泌，其中包含多种类型的核酸和各种蛋白质物质。包被在外泌体中的功能性核酸和蛋白质可以进入靶细胞，调节基因表达。这表明外泌体作为细胞间通讯的活性介质在生理和病理过程中发挥着重要作用。所以，外泌体被认为是诊断性生物标志物的潜在来源。实际上，已经表明外泌体miRNAs可以用于癌症的早期诊断。

高通量方法可以有效筛选潜在的诊断性miRNA生物标志物。然而，在设计此类研究时，必须全面考虑包括预分析变量和数据标准化在内的许多其他挑战。循环miRNAs的标准化和选取规格是一项复杂的任务。因此，大多数可用的模型是基于细胞中的背景基因表达谱推导出来的，其在外泌体中则完全不存在。

为了筛选可能的有助于KD诊断的miRNAs，我们比较了从KD患者的血清中和对照组血清中提取获得的外泌体miRNAs类型。我们使用计算方法来选择可用作诊断生物标志物的miRNAs队子，以解决内部选取标准的问题并提高稳定性。这些miRNAs对子可以将KD与感染性疾病以及与KD具有相似症状的JIA区分开来，表明这种生物标志物在临床上可适用于KD的诊断。

虽然几年前就有报道称，外泌体miRNAs可被用作潜在的生物标志物，但是在心血管疾病的临床实践中，这一点还几乎没有被调查和实施过。据我们所知，这是第一个成功从大量血清miRNAs中获得两对外泌体miRNAs被用作KD诊断的生物标志物的研究。

与以前基于miRNA对KD的研究相比，我们分离出了产量高并且纯度稳定的血清外泌体，确保了可靠的miRNA来源。我们还获得了这些微量外泌体miRNA的微阵列信号，这使得我们能够在相关分子途径知识所知甚少的情况下，评估所有已知miRNAs。这种不偏不倚的研究方法对于处理未知病因的疾病（如KD）大有裨益。

我们选择了KD患者与健康志愿者对照，以及接受IVIG治疗的患者和未接受IVIG治疗的患者对照，大大缩小了候选miRNA的数量，这允许单独的qRT-PCR验证和进一步的精确筛选。当我们进行最终验证，我们包括了ADV和EBV感染的发热对照组。此外，我们还招募了12名JIA患者和1名患有SF的患者，这些患者的临床表现和实验室检测均与KD患者相似。虽然样本量有限，这种方法比以前在病毒感染发热对照中验证候选生物标志物的策略更有效。在本研究中，对比KD患者和健康志愿者，五对miRNA符合P10-4的标准；但当我们考虑到KD和病毒感染对照组之间的比对时，只有一对miRNA仍然有意义。同时，后者的比较（即KD与病毒感染）也提供了一种反向miRNA对，这增强了特异性。

KD的病因仍不清楚，并且多种分子途径可能与KD的发病和发展有关，所以KD的诊断应使用多重标准而不是单一标准。我们的结果证实了这一设想，所以有必要使用两个miRNA对作为实现良好诊断效果的组合标准。这种策略与以往的使用单一标准进行简单诊断的研究不同。应用自我参照方案和使用多个标准，使我们能够产生稳定的生物标志物定量表现，最小化假阳性率和假阴性率。

对这些miRNA的功能了解甚少，特别是在心血管疾病的情况下，本研究主要集中于miRNA作为诊断生物标志物的潜在应用，提供了关于这些miRNA在KD中的相关性的见解，特别是关于对血管内皮细胞损伤的反应，值得进一步的对其机制进行研究。

这项研究还揭示了有关生物银行的冻存血清样品的生存力的有价值的信息，提示生物银行可以作为生物标志物发现的宝贵资源。在本研究中，我们开始使用冻存样品进行调查，并能够使用新鲜样品对外泌体miRNA进行生物标志物候选物的验证，这表明所提出的策略是高效的。我们目前的研究不仅提供了一套基于血清外泌体miRNA用于KD诊断的生物标志物，而且还展示了在机制知识所知甚少的情况下，利用丰富的生物资源为复杂疾病筛选有效生物标志物的策略。

我们首先从血清中分离鉴定获得外泌体，然后从μl血清中可以产生总共ng的RNA。紧接着我们使用miRNA微阵列比较筛选了健康志愿者和KD患者，以及KD患者在IVIG治疗前后明显改变的miRNAs。我们在两个微阵列中选择了具有显着变化（倍）的miRNAs，发现miR-a，miR--5p，miR--5p，miR-和miR--3p在两个微阵列中变化显著。它们在KD患者中以高丰度（log2强度4.5）被检测到，并且在健康个体和IVIG治疗的患者中检测不到。

为了验证微阵列结果，进一步缩小生物标志物的列表，我们进行了qRT-PCR，以量化上述候选miRNA。我们从生物银行的冻存样本中获取得到60个样本，包括来自20名健康个体的样本，接受IVIG治疗前20名KD患者的样本，和接受IVIG治疗后20名KD患者的样本。为了测试潜在生物标志物的特异性，我们还包括了5名腺病毒（ADV）感染的患者，因为KD在临床上容易被误诊为由ADV引起的感染性疾病。结果显示，miR-/miR-b-5p是唯一符合所有标准的生物标志物。miR--3p/miR--5p显示出与筛选标准完全相反的趋势，这表明它可以作为区分病毒感染与KD的附加生物标志物。事实上，miR-是有症状冠状动脉疾病的死亡预测因子，而循环miR-已被证明可以指示舒张功能障碍。这意味着我们选择的miRNAs可能会反映KD的心血管病变。

为了测试我们的潜在生物标志物的诊断能力，医院的新鲜血液样本。验证队列包括54名健康个体，54名未接受IVIG治疗的KD患者，10例ADV患者，13例Epstein-Barr病毒（EBV）患者，12例JIA患者和1例SF患者。我们绘制了验证队列中所有样本的两对miRNA的qRT-PCR定量结果，当分析这两对miRNA时，健康个体，KD患者和非KD患者可以清楚地被分为相应的三组，只有一个例外。这些发现表明这两对miRNA可以用作KD的生物标志物。值得注意的是，两对miRNA都不能独立地将KD患者与健康个体和具有病毒感染的患者区分开来，需要组合多个miRNA对。

作者：JiaHL,etal.

编译：王江凯

校审：姚品芳

原文：

SetsofserumexosomalmicroRNAsascandidatediagnosticbiomarkersforKawasakidisease.SciRep.Mar20;7:.doi:10./srep.