成功案例利用16s测序解读川崎病儿童

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湖南医院谭超超老师和曹友德老师合作在《Scientificreports》杂志上发表《AlteredgutmicrobiotacorrelatedwithsystemicinflammationinchildrenwithKawasakidisease》，文章研究的目的是调查川崎病儿童的粪便微生物菌群的变化，并评估其与系统性炎症的关系。其中高通量测序分析部分（微生物多样性）由百迈客协助完成。

摘要：

川崎病(Kawasakidisease，KD)是一种以多系统血管炎为特征的急性发热性疾病，主要发生在儿童身上，而肠道微生物菌群紊乱被认为是引发KD的高免疫反应。以前的报告表明，肠道菌群组成的改变会引发几种免疫介导的炎症性疾病，如炎症性肠道疾病、类风湿性关节炎和多发性硬化症。但是KD患儿肠道微生物菌群的组成与感染的关系尚未得到研究。本研究对16SrRNA基因V3-V4高变区进行测序，以全面了解KD患儿肠道微生物菌群组成，并探讨其与系统性炎症的关系。

实验材料：

KD患儿30例(平均年龄2.36±1.39岁；男：女17：13)和年龄性别匹配的健康儿童30例(平均年龄2.45±1.27岁；男：女16：14)：儿童的新鲜粪便样本

实验方法：

16SV3-V4

测序平台：

IlluminaHiSeq

图1样本收集流程

研究结果：

1、研究对象的特征KD患儿的体重、身高、分娩方式和喂养方式与健康对照组无显著性差异。川崎病患儿急性期血清IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ水平明显高于健康对照组。表1研究对象的特征2、急性川崎病患儿、健康对照和非急性川崎病患儿肠道微生物多样性的差异作者在三组样本中总共获得了个OTUS：急性KD组、非急性KD组和健康对照组分别检测到个、个和个OTUS（表2）。三组中所有序列的Good’s覆盖值都接近99%。稀疏曲线显示曲线略有不饱和(图2A)，表明如果进行更大的测序深度，将发现新的OTUS。但在所有三组中，Shannon指数曲线都已经达到了一个平台期(图2B)。结果表明，大多数粪便微生物菌群被捕获，为研究儿童粪便微生物菌群提供了良好的测序深度。通过α多样性指数，观察到非急性川崎病患儿的微生物菌群丰富度明显高于急性川崎病患儿和健康对照组。然而，ACE指数显示，急性KD儿童和健康对照组之间没有显著差异(图2C)，但是急性期KD儿童的生物多样性低于健康对照组和非急性期KD儿童。如Simpson指数(图2D)所示，健康对照组和非急性KD儿童在微生物生物多样性方面没有差别。这些结果说明KD儿童的肠道微生物菌群与生物多样性的丧失有关。表2K组、F组和H组之间的粪便微生物群落指数K：急性川崎病患儿，F：非急性川崎病患儿，N：健康对照。图2急性川崎病患儿、非急性川崎病患儿和健康对照的α多样性分析（A）稀疏曲线和香农指数曲线（B）用于估计三组间粪便微生物菌群的测序深度；（C）ACE指数显示非急性川崎病患儿细菌丰富度高于急性川崎病患儿和健康对照组；（D）Simpson指数显示，急性KD儿童的生物多样性低于非急性KD儿童和健康对照组。K：急性川崎病患儿，F：非急性川崎病患儿，N：健康对照。为了评估组间肠道微生物群落的相似性，通过基于未加权的UniFrac距离的PCoA来检测β多样性，结果显示急性KD儿童的粪便微生物菌群与健康对照组和非急性KD儿童有明显不同，非急性期和健康对照组的分离趋势比急性期和健康对照组更明显(图3)。KD儿童的特点是长期高烧，在正确诊断之前通常被误诊为感染。因此，大多数KD儿童接受了经验性的抗生素治疗，这可能会对肠道微生物菌群的组成产生长期影响。图3基于未加权UniFrac距离的PCoA图3、急性川崎病患儿、健康对照和非急性川崎病患儿微生物菌群组成的差异在三组粪便样本中，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门是四个主要的门，占所有序列的97%(图4A)。然而，作者在门的水平上没有观察到三个组在微生物组成上的显著差异。在属水平上，肠球菌(17.62%)、拟杆菌属(14.22%)、双歧杆菌属(11.97%)和志贺氏菌属(11.80%)是KD患儿粪便标本中最常见的属，拟杆菌属(20.41%)、粪杆菌属(10.93%)、双歧杆菌属(10.12%)和大肠杆菌属(7.51%)是KD患儿粪便标本中的优势菌属。结果表明，KD患儿粪便标本中以肠球菌属(17.62%)、拟杆菌属(14.22%)、双歧杆菌属(11.97%)和大肠埃希氏菌属(11.80%)为主。健康对照组优势菌属为拟杆菌属(18.70%)、志贺氏菌属(9.82%)、粪杆菌属(6.93%)和双歧杆菌属(6.86%)(图4B)，与之相比，健康人群中优势菌属为拟杆菌属(18.70%)、志贺氏菌属(9.82%)、粪杆菌属(6.93%)和双歧杆菌属(6.86%)。图4急性川崎病患儿、非急性川崎病患儿和健康儿童肠道菌群在门、属水平上的分布。

采用属水平的LEfSe分析方法，确定驱动急性川崎病患儿、健康对照和非川崎病患儿菌群分化的潜在细菌生物标志物。急性KD患儿肠球菌、不动杆菌、幽门螺杆菌、乳球菌、葡萄球菌、丁立单胞菌显著富集，普氏杆菌、口疮杆菌、梭状芽孢杆菌、优生菌、玫瑰花叶杆菌、巨型芽孢杆菌等单链脂肪酸产生菌群显著减少(图5)。

图5LEfSe鉴定急性KD儿童和健康儿童之间差异菌群(A)菌群LEfSe分析进化分枝图；(B)菌群LDA值分布柱状图。

作者还用LEfSe研究了KD急性期与非急性期肠道菌群组成的变化，观察到在急性KD患儿中肠球菌、明串珠菌、巨型单胞菌、幽门螺杆菌、摩根氏菌和乳球菌明显增多，而产生单链脂肪酸的微生物菌群包括布鲁氏菌、普雷沃泰氏菌、Dialister、梭状芽孢杆菌、玫瑰花杆菌、厌氧菌、瘤胃球菌和Dorea等明显增加（图6）。

图6LEfSe鉴定急性KD儿童和非急性KD儿童之间差异菌群（A）菌群LEfSe分析进化分枝图；（B）菌群LDA值分布柱状图。4、功能分析为了阐明KD患儿的正常生物学功能可能受到的影响，用PICRUST对粪便微生物菌群的功能基因组成进行了分析。与健康对照组相比，在KD患儿中糖代谢、外源性物质生物降解和代谢的功能基因富集程度较高。此外，急性KD患儿的辅因子和维生素代谢、环境适应、能量代谢和细胞运动功能基因富集程度均显著降低(图7A)。非急性KD患儿的碳水化合物代谢和异物生物降解代谢富集程度明显低于急性KD患儿(图7B)。图7基于KEGG通路的功能分析结果(A)急性KD儿童与健康对照组之间的功能差异；(B)急性KD患儿与非急性KD患儿的功能差异。5、肠道微生物菌群与感染标志物的相关性选择IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ等生物标志物评价KD患儿的系统性炎症情况。作者观察到有几种细菌与感染因子相关(如表3所示)。肠球菌和幽门螺杆菌与IL-6呈正相关(r=0.39，p=0.04；r=0.37，p=0.00)。表3特异性菌群丰度与血清炎症性生物标志物的相关性

结论：

本研究采用粪便16SrRNA基因测序方法，对KD患儿肠道微生物菌群组成进行了研究，并探讨其与系统性炎症的关系。研究观察到，急性KD儿童的特征是肠道微生物菌群失调，微生物多样性减少，肠道微生物菌群的组成也发生了变化。此外，还观察到肠道微生物菌群的紊乱与KD儿童的系统性感染有关。该研究结果为川崎病的病因提供了新的见解，这将加深对其发病机制的理解，并促进新的治疗方法的发展。

参考文献：

ChenJ,YueY,WangL,etal.AlteredgutmicrobiotacorrelatedwithsystemicinflammationinchildrenwithKawasakidisease.SciRep.Sep3;10(1):.文献下载：